HPLC
(Abkürzung von high performance oder high pressure liquid chromatography, Hochleistungs- oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie, schnelle Flüssigkeitschromatographie). Die HPLC ist eine Weiterentwicklung der klassischen Säulenflüssigkeitschromatographie, deren Effizienz durch eine Verkleinerung der Teilchengröße des Packungsmaterials sowie eine Instrumentalisierung wesentlich verbessert wurde. Man arbeitet bei der HPLC mit erheblich feinkörnigerem Material (3–10 μm) als bei der Gelchromatographie (35–75 μm) oder der Säulenchromatographie (120–200 μm). Noch kleinere Partikelgrößen (<2 μm) kommen bei der UHPLC zum Einsatz. Der Vorteil besteht in einer höheren Auflösung bei der Trennung (mehr als 100 Komponenten aus Gemischen sind möglich), einer drastischen Verkürzung der Analysendauer (von Stunden in den Bereich von Minuten und Sekunden) und einer Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit (<10−10 g); die Kriterien sind allerdings nicht unabhängig voneinander erreichbar.
Säulen und Versuchsbedingungen
Standard-Trennsäulen für die chromatographische Analytik besitzen Durchmesser zwischen 4 und 8 mm und Längen von 50–300 mm, die bei Flussraten von 0,5–5,0 mL ⋅ min−1 und Gegendrücken bis zu 400 bar betrieben werden. Sie werden im Allgemeinen als Edelstahlsäulen in den Handel gebracht, doch sind auch Glassäulen und spezielle Kartuschensysteme erhältlich. Geringere Innendurchmesser der Trennsäulen (Narrow bzw. Micro Bore-Technik) erfordern sehr kleine externe Totvolumina (Injektionsvolumen <0,5 μL, Detektorzellvolumen 0,5–4 μL, sehr kurze Kapillarverbindungen) und niedrige Flussraten von 10–100 μL ⋅ min−1, einstellbar in 1 μL-Schritten. Auf diese Weise erreicht man besonders hohe Trennleistungen mit theoretischen Bodenzahlen um 20000/m, in manchen Fällen sogar bis 60000/m. Für (semi)präparatives Arbeiten sind Säulendurchmesser von 8–30 mm bei Flussraten von meist 5–20 mL ⋅ min−1 bei Gegendrücken von 50–150 bar üblich.
Für technische Anwendungen werden Säulen bis 300 mm und darüber eingesetzt, bei denen eine Anlagenplanung sowie die Beachtung gesetzlicher Vorschriften (Druckbehälterverordnung, Ex-Vorschriften und andere) notwendig sind.
Die Elution kann im einfachsten Fall mit einem Lösemittel oder einem konstanten Lösemittel-Gemisch isokratisch erfolgen. Schwierige Trennprobleme verlangen dagegen Gradientenelution, bei der die Zusammensetzung der mobilen Phase kontinuierlich geändert wird. Für einige Anwendungen ist die Kontrolle der Temperatur, z. B. durch einen Säulenofen, wichtig. Meist wird bei 20–30 °C gearbeitet. Hochtemperatur-HPLC mit Temperaturen von z. B. 90 °C ist beschrieben[1].
Trägermaterialien
Aufgrund der permanenten Porosität und hohen Druckbeständigkeit stellen Kieselgele unterschiedlicher Oberflächenzusammensetzung mit mehr als 50 % Marktanteil die wichtigsten Trägermaterialien dar. Neben den mit funktionellen Gruppen chemisch modifizierten Kieselgelen haben sich besonders unpolare stationäre Phasen (reverse Phasen, mit alkylsilyliertem Kieselgel) durchgesetzt (RP-HPLC, Reversed-phase-HPLC, siehe Reversed-phase-Chromatographie). Sie werden ergänzt durch vernetzte Polymerträger und zu geringen Anteilen durch poröse anorganische Oxide mit Aluminium und Zirconium. Während mit porösen Partikeln gepackte Säulen sehr häufig im Einsatz sind, sind darüber hinaus auch monolithische HPLC-Säulen verfügbar[2]. Sie bestehen aus einem porösen Kieselgel-Skelett mit unterschiedlich großen und kleinen Poren, die durch spezielle Verfahren (Sol-Gel-Methode) mit hochreinen, metallfreien Alkoxysilanen hergestellt werden. Diese Säulen haben den Vorteil einer deutlich schnelleren Trennung, unter anderem weil sie höhere Flussraten erlauben[2]. Das Hauptproblem bei deren Anwendung ist die vergleichsweise schlecht reproduzierbare Herstellung der Porenstruktur der monolithischen Säule. Die analytische Trennleistung variiert daher unter Umständen von Säule zu Säule[3].
Bei mit Partikeln gepackten Säulen wird die Trennleistung der HPLC neben der chemischen Beschaffenheit des Trägermaterials auch maßgeblich von der verwendeten Partikelgröße bestimmt. Kleinere Partikelgrößen führen gemäß Van-Deemter-Gleichung zu einer erhöhten Trennleistung, bedingen jedoch einen höheren Fließwiderstand und verursachen deshalb bei konstanter Fließrate der mobilen Phase einen erhöhten Gegendruck. Der Einsatz von HPLC ermöglicht chromatographische Trennungen unter Verwendung von 3–10 μm Partikeln in der Regel bei einem Gegendruck <300 bar. Die Verwendung von Partikelgrößen unter 2 μm (sub-2 μm) wurde erst im Jahr 2004 durch die Einführung von sogenannten Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographen (ultra high performance liquid chromatography, UHPLC) zugänglich, da die enorm erhöhten Gegendrücke von bis zu 1200 bar besondere Anforderungen an die physikalisch-technische Beschaffenheit der Geräte und Säulen stellen. Die erhöhte Trennleistung dieser UHPLC-Trennsäulen führt zu deutlich verkürzten Analysendauern.
Eine der UHPLC-ähnliche Trennleistung wird neuerdings für Kern-Hülle-Partikel (Core-shell-Partikel, core-shell particles, solid-core particles) auch bei einer Partikelgröße >2 μm beschrieben. Im Unterschied zu konventionellen vollporösen Partikeln bestehen Kern-Hülle-Partikel aus einem festen undurchlässigen Kern und einer porösen Hülle. Ferner wird herstellungsbedingt eine sehr enge Partikelgrößenverteilung erzielt, wodurch in der Säulenpackung nur vergleichsweise kleine Hohlräume zwischen den Partikeln entstehen. Im Vergleich zu vollporösen Partikeln wird dadurch die Diffusion der Analyten ins Innere der Partikel sowie die Diffusion entlang der longitudinalen Säulenachse limitiert. Die erreichte Trennleistung kommt bei vielen Reversed-phase-Chromatographie-Anwendungen bereits bei deutlich reduzierten Gegendruck der Trennleistung von UHPLC-Säulen nahe[3,4].
Auswertung
Wichtige Parameter für die qualitative Auswertung sind die sogenannte Totzeit (to), die Nettoretentionszeit (tR) sowie die daraus resultierende Gesamtretentionszeit (tg), die über die Volumen-Geschwindigkeit mit den entsprechenden Retentionsvolumen verknüpft ist. Die quantitative Auswertung erfordert die Erstellung von Eichmessungen definierter Konzentrationen der entsprechenden Standardsubstanzen und erfolgt über die Peak-Flächen oder über die Peakhöhen.
Detektion und Methodenkopplung
Zur Detektion werden hauptsächlich photometrische Ein- und Mehrkanaldetektoren sowie Photodiodenarray- (siehe Diodenarray), refraktometrische (RI) und elektrochemische, in geringerem Umfang Fluoreszenzdetektoren (Fluoreszenzspektroskopie) mit Durchflusszellen eingesetzt[5]. Verschiedene Kopplungsverfahren sind gebräuchlich. Das derzeit wichtigste ist die HPLC-Massenspektrometrie. Zur Entfernung des Lösemittels und Erzeugung von Ionen wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Aktuell sind die ESI (Elektrospray-Ionisation) und APCI (atmospheric pressure chemical ionisation)[6]; ältere Techniken waren MB (moving belt), TSP (Thermospray-Ionisation) und PB (particle beam) sowie CF-FAB (continuous-flow fast atom bombardement). Eine neuere Methode ist die Photoionisation (APPI, atmospheric pressure photoionisation), mit der auch durch ESI oder APCI schwer ionisierbare Moleküle ausreichende Ionenausbeuten liefern sollen[7,8]. Die Kopplung von HPLC und ICP-MS ist ebenfalls etabliert[9]. Weitere realisierte Kopplungen sind LC-FTIR und LC-NMR[9-11].
Insbesondere bei Biopolymeren spielt die Kopplung mit MALDI-TOF-MS eine zunehmend wichtige Rolle[12,13]. LC-GC-Kopplungen sind bereits seit geraumer Zeit beschrieben und werden gelegentlich eingesetzt[14].
Anwendung
HPLC-Trennungen können schnell, mit hoher Auflösung und in schonender Weise durchgeführt werden und sind daher insbesondere zur Analyse und zur präparativen Isolierung biologischer Materialien geeignet. Für die Umweltanalytik bedeutsam ist die HPLC unter anderem für Nachweis und Bestimmung von unterschiedlichen Kohlenwasserstoffen (z. B. von polycyclischen Aromaten), halogenierten Kohlenwasserstoffen, Phenolen, Pestiziden sowie von Anionen und Kationen. In der chemischen Synthese erlaubt die Anwendung chiraler Phasen Enantiomerentrennung[15]. Im Lebensmittelsektor dient die HPLC zur Rückstandsanalytik (Erfassung von Resten von Pflanzenschutzmitteln, Antibiotika, Hormonen in Nahrungsmitteln) und zur Erfassung von Aromakomponenten. In den Biowissenschaften wird die HPLC zur Sequenzanalyse von Proteinen, zur Trennung von Nucleinsäure- und Peptid-Fragmenten (Peptid-Mapping) und Proteinen, zur Analyse und zur Trennung komplizierter Gemische unter präparativen Bedingungen (FPLC®-System) sowie zur Überprüfung der Produktreinheit eingesetzt.
Literatur
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Unger, K. K.; Weber, E., Hrsg., Handbuch der HPLC, Teil 1: Leitfaden für Anfänger und Praktiker, 2. Aufl.; GIT: Darmstadt, (1995)
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Übersetzungen:
| E | high-performance liquid chromatography, high-pressure liquid chromatography |
| F | chromatographie liquide de haute capacité, chromatographie liquide de haute pression (CLHP) |
| I | chromatografia su colonna ad alta pressione, HPLC |
| S | chromatografía [en fase] líquida de alta eficacia (resolución) (presión) |