kurze offene Leseraster
(sORF, von short open reading frame). Offene Leseraster werden als kurz einstuft, wenn sie weniger als 100 bis 150 Codons enthalten. Diese künstlich gezogene Grenze basiert darauf, dass bei der Suche nach Proteine-codierenden Genen mit computergestützten Methoden kürzere Nucleinsäure-Sequenzen zunächst außer Acht gelassen werden, um in jedem Genom zufallsbedingt vorhandene, aber funktionell bedeutungslose kurze offene Leseraster auszuschließen. Dessen ungeachtet können auch kurze offene Leseraster transkribiert und in ribosomal synthetisierte Peptide bzw. kleine Proteine übersetzt werden oder die Transkripte erfüllen regulatorische Funktionen im Zusammenhang mit der Translation. Physiologisch relevante kurze offene Leseraster sind bei allen Lebewesen sowie bei Viren bekannt. Sie befinden sich auf den unterschiedlichsten Typen von RNA, darunter vermeintlich nicht codierende Transkripte (ncRNA, lincRNA = long intergenic noncoding RNA), Introns, mRNA oder rRNA[1].
Abbildung: Kurze offene Leseraster befinden sich auf verschiedensten Transkripten[1]. Auch vormals als nicht codierend eingestufte RNA (lncRNA) kann physiologisch relevante kurze offene Leseraster enthalten, die translatiert werden. Diese können aus einem Exon bestehen (z. B. beim Phospholamban), durch Spleißen aus mehreren Exons zusammengesetzt werden (z. B. bei Myoregulin) oder polycistronisch angeordnet sein (z. B. Tarsal-less). Bei Pflanzen wurden kleine Peptide-codierende offene Leseraster auf dem Primärtranskript von miRNA (pri-miRNA) nachgewiesen. Die Bedeutung von kurzen offenen Leserastern auf rRNA (z. B. Humanin) ist wegen im Zellkern codierter Isoformen noch nicht endgültig geklärt. mRNA kann kurze offene Leseraster vor (upstream), nach (downstream) oder innerhalb der codierenden Hauptsequenz enthalten, häufig mit versetztem Leseraster. Vor dem Spleißen des Primärtranskripts von mRNA (pre-mRNA) können kurze offene Leseraster innerhalb von Introns transkribiert werden und liefern Peptide für die Antigenpräsentation durch das Histokompatibilitätsantigen MHC I.
Die von kurzen offenen Leserastern gebildeten Translationsprodukte, die sogenannten Mikropeptide oder kleinen Proteine, sind unmittelbar nach der Translation funktionsfähig. Im Gegensatz zu anderen bioaktiven Peptiden werden sie nicht aus größeren Vorläuferpeptiden freigesetzt. Translationsprodukte kleiner offener Leseraster sind bislang (Stand 2019) nur in wenigen Fällen nachgewiesen und funktionell charakterisiert[2,3]. Die Assoziation der entsprechenden Abschnitte des Transkripts mit Ribosomen gilt jedoch als Indiz, dass sie entweder translatiert werden oder die Translation von flussabwärts liegenden offenen Leserastern regulieren.
Analytischer Nachweis
Die Identifizierung kurzer offener Leseraster erfolgt mittels computergestützter Analyse von Nucleinsäure-Sequenzen unter Berücksichtigung der Sequenzähnlichkeit zwischen Spezies[1,4,5]. Wie bei anderen Proteine-codierenden offenen Leserastern gilt dabei eine während der Evolution konservierte Nucleinsäure-Sequenz als Indiz für eine funktionelle Bedeutung[6]. Die Assoziation von kurzen offenen Leserastern mit Ribosomen wird nach Art des Foot print durch RNase-Verdau und Sequenzierung der vom Ribosom geschützten Bereiche nachgewiesen (sogenanntes ribosome profiling oder Ribo-Sequ). Dabei gilt die Freisetzung der Ribosomen nach dem im Leseraster enthaltenen Stop-Codon als ergänzendes Kriterium für translatierte offene Leseraster[7,8]. Die Identifizierung der Peptide erfolgt durch Proteomik bzw. Peptidomik mittels Massenspektrometrie[9].
Funktionen
Sowohl die Transkripte als auch die Translationsprodukte kurzer offener Leseraster können physiologische Funktionen innehaben. Von kurzen offenen Leserastern codierte kleine Proteine üben vor allem regulatorische Funktionen aus, entweder durch Interaktion mit anderen Proteinen oder mit Nucleinsäuren. Ein Beispiel für ein kleines Protein mit enzymatischer Aktivität ist die 4-Oxalocrotonat-Tautomerase.
Upstream-ORF
(uORF). Etwa 30 bis 50 % aller Transkripte von Säugern und Pflanzen enthalten konservierte kurze offene Leseraster, deren Start-Codon vor dem 5′-Ende der codierenden Hauptsequenz liegt. Werden sie durch den Präinitiationskomplex erkannt, der das Transkript vom 5′-Ende her nach Start-Codons absucht, nehmen sie Einfluss auf die Translation der flussabwärts liegenden Hauptsequenz[10]. Indem sie das Ribosom aufhalten, seine Dissoziation fördern oder den nonsense-mediated mRNA-decay induzieren, wirken sie überwiegend hemmend. Diese Wirkung kann selbst die Kombination eines Start-Codons mit einem unmittelbar darauffolgenden Stop-Codon erzielen[11].
Auch vom upstream-ORF codierte Peptide, die an RNA binden und als cis-wirkende Elemente deren Translation hemmen, wurden nachgewiesen. Sofern ihre Bindungsfähigkeit durch niedermolekulare Substanzen reguliert wird, spricht man vom Peptidoswitch (vgl. Riboswitches).
Je nach Lage und Länge können upstream-ORF die Translation der Hauptsequenz auch fördern, insbesondere bei Genen, die im Rahmen der zellulären Antwort auf Stress induziert werden. Dabei wird entweder das Start-Codon des upstream-ORF übersprungen oder, nach der Translation des upstream-ORF, die Reinitiation am Start-Codon der Hauptsequenz gefördert. Mutationen in der 5′-untranslatierten Region von Transkripten, die entweder die Wirkung bestehender upstream-ORF verändern oder zusätzliche upstream-ORF einführen, gelten als Ursache seltener Erbkrankheiten[10].
Mikropeptide
Von kurzen offenen Leserastern gebildete Mikropeptide finden sich in allen Reichen der Lebewesen sowie bei Viren.
Virale Mikropeptide sind häufig stark hydrophob. Sie inserieren in Zellmembranen, interagieren mit der Transmembrandomäne (siehe Transmembranproteine) integraler Membranproteine der infizierten Zelle und beeinflussen deren physiologische Aktivität[12]. Beispielsweise vermittelt das Vpu-Peptid (81 Aminosäuren) des HIV die Retention von CD4 (siehe Differenzierungscluster) im endoplasmatischen Retikulum infizierter T-Helferzellen sowie seine Bindung an einen E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex und somit seine Degradation. Beides verhindert die Exposition dieses für die Funktion der T-Helferzellen essentiellen Zelloberflächenantigens.
Kleine Proteine von Bakterien, die hydrophobe oder amphipathische Helices bilden, sind Bestandteil von Toxin-Antitoxin-Systemen oder regulieren an der Zellmembran die Aktivität von Proteasen oder Sensorkinasen bzw. Transportvorgänge[13].
Bei Hefen charakterisierte kleine Proteine wirken im Cytoplasma oder im Zellkern und beteiligen sich unter anderem an der Regulation von Enzymaktivitäten bzw. des Eisen-Haushalts[14].
Bei Pflanzen sind eine Reihe kleiner Peptide entwicklungsbiologisch oder bei der Reaktion auf oxidativen Stress relevant[15,16].
Ausgewählte Beispiele von Mikropeptiden mit bekannter Funktion siehe Tabelle und Literatur[17].
AcrZ, acridine resistance complex Z (Escherichia coli, Enterobakterien) | zwischen zwei für den Molybdän-Stoffwechsel relevanten Operons | hydrophob, α-helical gefaltet, bindet als Aktivator an die Transmembrandomäne des Antibiotika-Resistenz vermittelnden Multi-drug-Resistenz-Proteins AcrAB-TolC[18] | ||
Tautomerisierung von β,γ-ungesättigten Enonen zum α,β-Isomer (EC: 5.3.2.6) für deren Verwertung als Energiesubstrate[19] | ||||
Tarsal-less (Tal)-, auch Polished-rice (Pri)-Peptide (Drosophila melanogaster) | allosterischer Aktivator einer Ubiquitin-E3-Ligase; bewirkt die proteolytische Prozessierung von shavenbaby, eines Repressors der Transkription, dessen verkürzte Variante als Aktivator wirkt[20] | |||
Bindung an Cdk9 (Cyclin-abhängige Kinase), eine Komponente des positive transcription elongation factor b (P-TEFb), verhindert dessen Rekrutierung an die DNA und hemmt so die Transkription durch RNA-Polymerase II[21] | ||||
mutmaßlich polycistronische mRNA mit zwei kurzen offenen Leserastern (Drosophila) | Transmembranproteine, interferieren mit dem Stoffwechsel der Phosphoinositide und hemmen so die Reifung von Endosomen bzw. Phagosomen[22] | |||
Phospholamban, Sarcolipin, DWORF, Myoregulin, Endoregulin (Säugetiere), Sarcolamban (Drosophila melanogaster) | hydrophob, regulieren den Calcium-Transport durch SERCA[23-25] | |||
nobody, negative regulator of P-body association | Interaktion mit dem Decapping-Komplex, regulatorische Funktion beim Abbau von Ribonucleinsäuren[26] | |||
SPAR, small regulatory polypeptide of amino acid response (Säugetiere) | interagiert in Muskelzellen mit der lysosomalen V-ATPase und verhindert die Aktivierung des Nährstoffsensors mTOR durch Aminosäuren; für die Muskelregeneration wird diese Blockade aufgehoben, indem die Expression von SPAR durch Abbau des Transkripts herunterreguliert wird[27] | |||
apelin receptor early endogenous ligand, auch Apela, Toddler | 32 (reifes Peptid nach Abspaltung des Signalpeptids für den Import in das endoplasmatische Retikulum) | Agonist des G-Protein-gekoppelten Apelin-Rezeptors; Motogen, das in der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren die Wanderung von Mesoderm-Zellen steuert[28] |
Bifunktionale RNA mit kurzem offenem Leseraster
Transkripte, die selbst regulatorische Funktionen wahrnehmen, können zusätzlich kurze offene Leseraster enthalten, die in regulatorisch wirksame Peptide übersetzt werden.
Bei Escherichia coli regulieren das Transkript SgrS und das darauf codierte kleine Protein SgrT (43 Aminosäuren) in konzertierter Aktion den Import von Glucose bei Störungen der Glucose-Verwertung, die zur Akkumulation von Glucose-6-phosphat in der Zelle führen. Dabei hemmt das Transkript SgrS als siRNA die Expression des Glucose-Transporters PtsG, und SgrT interagiert als Inhibitor der Transportaktivität mit noch vorhandenen Transportern in der Zellmembran[29].
Bei Leguminosen werden sowohl dem Transkript von early nodulin 40 (ENOD40) als auch den zwei darauf codierten kurzen Peptiden von 13 bzw. 27 Aminosäuren regulatorische Funktionen in der frühen Phase der Ausbildung von Wurzelknöllchen zugeschrieben[30].
Literatur
[1] Plaza, S.; Menschaert, G.; Payre, F., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., (2017) 33, 391–416; https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-100616-060516 [Prüfdatum 18.05.2020]
[2] Landry, C. R.; Zhong, X.; Nielly-Thibault, L.; Roucou, X., Curr. Opin. Struct. Biol., (2015) 32, 74–80; https://doi.org/10.1016/j.sbi.2015.02.017 [Prüfdatum 18.05.2020]
[3] Yeasmin, F.; Yada, T.; Akimitsu, N., Front. Genet., (2018) 9, 144; https://doi.org/10.3389/fgene.2018.00144 [Prüfdatum 18.05.2020]
[4] Lin, M. F.; Jungreis, I.; Kellis, M., Bioinformatics, (2011) 27, i275–i282; https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr209 [Prüfdatum 18.05.2020]
[5] Makarewich, C. A.; Olson, E. N., Trends Cell Biol., (2017) 27, 685–696; https://doi.org/10.1016/j.tcb.2017.04.006 [Prüfdatum 18.05.2020]
[6] Mackowiak, S. D.; Zauber, H.; Bielow, C.; Thiel, D.; Kutz, K.; Calviello, L.; Mastrobuoni, G.; Rajewsky, N.; Kempa, S.; Selbach, M.; Obermayer, B., Genome Biol., (2015) 16, 179; https://doi.org/10.1186/s13059-015-0742-x [Prüfdatum 18.05.2020]
[7] Ingolia, N. T.; Brar, G. A.; Rouskin, S.; McGeachy, A. M.; Weissman, J. S., Nat. Protoc., (2012) 7, 1534–1550; https://doi.org/10.1038/nprot.2012.086 [Prüfdatum 18.05.2020]
[8] Guttman, M.; Russell, P.; Ingolia, N. T.; Weissman, J. S.; Lander, E. S., Cell, (2013) 154, 240–251; https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.06.009 [Prüfdatum 18.05.2020]
[9] Slavoff, S. A.; Mitchell, A. J.; Schwaid, A. G.; Cabili, M. N.; Ma, J.; Levin, J. Z.; Karger, A. D.; Budnik, B. A.; Rinn, J. L.; Saghatelian, A., Nat. Chem. Biol., (2013) 9, 59–64; https://doi.org/10.1038/nchembio.1120 [Prüfdatum 18.05.2020]
[10] Silva, J.; Fernandes, R.; Romão, L., Adv. Exp. Med. Biol., (2019) 1157, 99–116; https://doi.org/10.1007/978-3-030-19966-1_5 [Prüfdatum 18.05.2020]
[11] Tanaka, M.; Sotta, N.; Yamazumi, Y.; Yamashita, Y.; Miwa, K.; Murota, K.; Chiba, Y.; Hirai, M. Y.; Akiyama, T.; Onouchi, H.; Naito, S.; Fujiwara, T., Plant Cell, (2016) 28, 2830–2849; https://doi.org/10.1105/tpc.16.00481 [Prüfdatum 18.05.2020]
[12] DiMaio, D., Annu. Rev. Microbiol., (2014) 68, 21–43; https://doi.org/10.1146/annurev-micro-091313-103727 [Prüfdatum 18.05.2020]
[13] Alix, E.; Blanc-Potard, A. B., Mol. Microbiol., (2009) 72, 5–11; https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.06626.x [Prüfdatum 18.05.2020]
[14] Erpf, P. E.; Fraser, J. A., Proteomics, (2018) 18, e1700219; https://doi.org/10.1002/pmic.201700219 [Prüfdatum 18.05.2020]
[15] Hanada, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2013) 110, 2395–2400; https://doi.org/10.1073/pnas.1213958110 [Prüfdatum 18.05.2020]
[16] Hsu, P. Y.; Benfey, P. N., Proteomics, (2018) 18, e1700038; https://doi.org/10.1002/pmic.201700038 [Prüfdatum 18.05.2020]
[17] Andrews, S. J.; Rothnagel, J. A., Nat. Rev. Genet., (2014) 15, 193–204; https://doi.org/10.1038/nrg3520 [Prüfdatum 18.05.2020]
[18] Hobbs, E. C.; Yin, X.; Paul, B. J.; Astarita, J. L.; Storz, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2012) 109, 16696–16701; https://doi.org/10.1073/pnas.1210093109 [Prüfdatum 18.05.2020]
[19] Rahimi, M.; van der Meer, J.-Y.; Geertsema, E. M.; Poelarends, G., ChemBioChem, (2017) 18, 1435–1441; https://doi.org/10.1002/cbic.201700121 [Prüfdatum 18.05.2020]
[20] Zanet, J.; Benrabah, E.; Li, T.; Pélissier-Monier, A.; Chanut-Delalande, H.; Ronsin, B.; Bellen, H. J.; Payre, F.; Plaza, S., Science, (2015) 349, 1356–1358; https://doi.org/10.1126/science.aac5677 [Prüfdatum 18.05.2020]
[21] Hanyu-Nakamura, K.; Matsuda, K.; Cohen, S. M.; Nakamura, A., Development, (2019) 146, dev167056; https://doi.org/10.1242/dev.167056 [Prüfdatum 18.05.2020]
[22] Pueyo, J. I.; Magny, E. G.; Sampson, C. J.; Amin, U.; Evans, I. R.; Bishop, S. A.; Couso, J. P., PLoS Biol., (2016) 14, e1002395; https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002395 [Prüfdatum 18.05.2020]
[23] Magny, E. G.; Pueyo, J. I.; Pearl, F. M.; Cespedes, M. A.; Niven, J. E.; Bishop, S. A.; Couso, J. P., Science, (2013) 341, 1116–1120; https://doi.org/10.1126/science.1238802 [Prüfdatum 18.05.2020]
[24] Anderson, D. M.; Makarewich, C. A.; Anderson, K, M.; Shelton, J. M.; Bezprozvannaya, S.; Bassel-Duby, R.; Olson, E. N., Sci. Signal., (2016) 9, ra119; https://doi.org/10.1126/scisignal.aaj1460 [Prüfdatum 18.05.2020]
[25] Nelson, B. R.; Makarewich, C. A.; Anderson, D. M.; Winders, B. R.; Troupes, C. D.; Wu, F.; Reese, A. L.; McAnally, J. R.; Chen, X.; Kavalali, E. T.; Cannon, S. C.; Houser, S. R.; Bassel-Duby, R.; Olson, E. N., Science, (2016) 351, 271–275; https://doi.org/10.1126/science.aad4076 [Prüfdatum 18.05.2020]
[26] D'Lima, N. G.; Ma, J.; Winkler, L.; Chu, Q.; Loh, K. H.; Corpuz, E. O.; Budnik, B. A.; Lykke-Andersen, J.; Saghatelian, A.; Slavoff, S. A., Nat. Chem. Biol., (2017) 13, 174–180; https://doi.org/10.1038/nchembio.2249 [Prüfdatum 18.05.2020]
[27] Matsumoto, A.; Pasut, A.; Matsumoto, M.; Yamashita, R.; Fung, J.; Monteleone, E.; Saghatelian, A.; Nakayama, K. I.; Clohessy, J. G.; Pandolfi, P. P., Nature (London), (2017) 541, 228–232; https://doi.org/10.1038/nature21034 [Prüfdatum 18.05.2020]
[28] Pauli, A.; Norris, M. L.; Valen, E.; Chew, G. L.; Gagnon, J. A.; Zimmerman, S.; Mitchell, A.; Ma, J.; Dubrulle, J.; Reyon, D.; Tsai, S. Q.; Joung, J. K.; Saghatelian, A.; Schier, A. F., Science, (2014) 343, 1248636; https://doi.org/10.1126/science.1248636 [Prüfdatum 18.05.2020]
[29] Lloyd, C. R.; Park, S.; Fei, J.; Vanderpool, C. K., J. Bacteriol., (2017) 199, e00869-16; https://doi.org/10.1128/JB.00869-16 [Prüfdatum 18.05.2020]
[30] Bardou, F.; Merchan, F.; Ariel, F.; Crespi, M., Biochimie, (2011) 93, 1950–1954; https://doi.org/10.1016/j.biochi.2011.07.028 [Prüfdatum 18.05.2020]
Martinez, T. F.; Chu, Q.; Donaldson, C.; Tan, D.; Shokhirev, M. N.; Saghatelian, A., Nat. Chem. Biol., (2020) 16, 458–468; https://doi.org/10.1038/s41589-019-0425-0 [Prüfdatum 18.05.2020]
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